A-2-1 〇伊藤 孝哉^1,2、坂井 敦²、丸山 基世^2,3、宮川 世志幸⁴、岡田 尚巳⁴、深山 治久¹、鈴木 秀典² Ito Takaya^1,2, Sakai Atsushi², Maruyama Motoyo^2,3, Miyagawa Yoshitaka⁴, Okada Takashi⁴, Fukayama Haruhisa¹, Suzuki Hidenori^{2 1}東京医科歯科大・院医歯、²日本医科大・医・薬理、³日本医科大・医・実験動物管理室、⁴日本医科大・医・分子遺伝医学 体性感覚系の障害に起因する神経障害性疼痛はしばしば慢性に経過し、QOLを著しく損なうことから積極的に治療を行うことが求められている。しかしながら、本疾患の病態分子基盤には不明な点が多く、現状の疼痛治療は効果が十分とはいえない。一次感覚神経は神経障害性疼痛の主要な原因部位であり、同部位における遺伝子発現変化は疼痛の大きな要因となっている。ホメオボックス遺伝子に属する転写因子であるDorsal Root Ganglia Homeobox (DRGX)は、発生期において侵害受容性の一次感覚神経の生存に必須であり、DRGXの欠損により侵害受容神経が脱落することで、痛みの鈍麻を引き起こすことが報告されている。しかし、発達後の侵害受容神経におけるDRGXの役割は未だ明らかになっていない。そこで本研究では、神経障害性疼痛に対するDRGXの関与を検討することを目的とした。神経障害性疼痛モデルとして、雄性ラットの第5腰髄（L5）神経を結紮したSNLモデルを作製した。L5後根神経節におけるDRGXのmRNA発現量を定量PCR法により測定すると、神経障害後早期から持続的に減少していた。In situ hybridizationにより、DRGXは主に侵害受容性神経を構成する小型から中型の神経細胞に多く発現していたが、神経障害によりその割合が減少することが明らかになった。さらに、血清型6アデノ随伴ウイルスベクター(AAV6)の微量注入により、一次感覚神経特異的にshRNAによるDRGXの発現抑制を行うと、健常ラットの痛覚閾値が低下した。一方で、SNLモデルラットの一次感覚神経にDRGXを遺伝子導入すると、神経障害性疼痛が緩和された。また、DRGX欠損マウスの前脳で発現変化が報告されている遺伝子群のうち、疼痛との関連が知られている遺伝子の発現がSNLまたはDRGXの発現抑制により後根神経節で上昇していた。さらに、それらの疼痛関連遺伝子のSNLによる発現上昇はDRGXを遺伝子導入することで抑制された。以上の結果より、DRGXは一次感覚神経において痛覚関連遺伝子の発現を制御することで、神経障害性疼痛に寄与していることが明らかになった。

A-2-2 〇吉田 有輝^1,2、高橋 英希^2,3、小野 晴香^2,3、目黒 由行^2,4、宮野 加奈子²、野中 美希²、水口 貴章³、平山 重人^2,3、小林 正樹¹、藤井 秀明³、樋上 賀一¹、上園 保仁^2,5,6 Yuki Yoshida^1,2, Hideki Takahashi^2,3, Haruka Ono^2,3, Yoshiyuki Meguro^2,4, Kanako Miyano², Miki Nonaka², Takaaki Mizuguchi³, Shigeto Hirayama^2,3, Masaki Kobayashi¹, Hideaki Fuji³, Yoshikazu Higami¹, Yasuhito Uezono^{2,5,6 1}東京理科大・院薬、²国立がん研究センター研究所・がん患者病態生理研究分野、³北里大・薬、⁴自治医科大・消化器・一般移植外科、⁵国立がん研究センター・先端医療開発センター・支持療法開発分野、⁶国立がん研究センター中央病院・支持療法開発部門 【目的】Oxytocin（OT）は、母性・社会行動の形成、子宮収縮など幅広い生理作用をもつ。OTニューロンは脳内や脊髄にも投射しており、神経終末からのOT放出により鎮痛作用を示すことが近年明らかとなってきた。ラットを用いたin vivo実験において、OTの鎮痛作用はオピオイド受容体（OR）拮抗薬により部分的に抑制されることから、内因性オピオイドシグナルを介した鎮痛作用機序の存在が示唆されているが、その詳細は明らかとなっていない。そこで本研究では、OTがOR（μOR, δOR, κOR）に対してORアゴニストとして作用するか、またはORアゴニストと異なる部位に結合し、アゴニスト活性を促進するpositive allosteric modulator（PAM）作用を示すかについて各種OR発現細胞を用いて解析を行った。
【方法】ORの活性はμOR, δOR, κORを安定発現させたHEK293細胞を用いてCellKey^TMシステムにより評価した。CellKey^TMシステムは、化合物の活性を電気抵抗値の変化として測定できる活性評価システムである。
【結果】OTがORのアゴニストとして作用を持つか検討するために、各種OR発現HEK293細胞に対してOTを処置したところ、μOR, δORおよびκORに対して直接活性効果は認められなかった。次に、OTがORの内因性アゴニストを増強するか、すなわちPAMとしての作用を有するかを検討したところ、10^-6M のOTはμORの内因性アゴニストendomorphin-1によるμOR活性を有意に増強し、さらに、κORの内因性アゴニスト dynorphin AによるκOR活性も有意に増強した。興味深いことに、δORの内因性アゴニスト Met-およびLeu-enkephalinによるδOR活性に対しては、OTはほとんど影響を与えなかった。
【まとめ】以上の結果より、OTはORアゴニストとしては作用せず、μORおよびκORのPAMとしてORの活性を上昇させることが考えられた。本研究より、OTはμORおよびκORを介する鎮痛作用を増強することにより、新規鎮痛剤としてdrug repositioningできる可能性が示された。現在、OTのPAM作用の発現に重要なアミノ酸配列ならびにOTの立体構造の同定を目指し実験をすすめている。

A-2-3 〇河野 玲奈¹、大柿 安里¹、池谷 裕二¹、小山 隆太^1,2 Kono Rena¹, Ari Ogaki¹, Yuji Ikegaya¹, Ryuta Koyama^{1,2 1}東京大・院薬・薬品作用、²科学技術振興機構 PM_2.5に代表される大気中の微粒子は脳機能に影響を及ぼす可能性がある。PM_2.5の中でもナノオーダーの粒径を持つ微粒子は容易に体内へと侵入し、ヒトの脳内でも発見されている。また、疫学的調査により、若齢期から微粒子に曝露されると認知機能の低下やADHD・鬱などの精神疾患の発症の間につながることが示唆されているが、具体的なメカニズムは明らかではない。そこで本研究では脳内に侵入した微粒子が脳機能に影響するメカニズムの解明を目的とし、日本に飛来する代表的なPM2.5である黄砂の主成分「シリカ」の微粒子が脳機能に与える影響を実験的に検証した。まず、空気中のPM2.5の呼吸による吸入を模倣するため、成体マウスに微粒子を経鼻投与した。その脳切片を観察したところ、微粒子は嗅球から海馬まで脳内の広範囲において発見された。さらに、免疫染色によって微粒子は脳内免疫細胞であるマイクログリアをはじめとして、様々な細胞種に取り込まれていることが明らかになった。次に、微粒子への曝露が脳機能に与える影響を検証した。小児期に微粒子を投与された仔マウスに対し居住者・侵入者テストを行ったところ、微粒子処置群はコントロール群に比べ成体期において攻撃性の上昇が観察された。次に、微粒子の取り込みが脳内細胞に与える影響を詳しく調べるため、培養系を用いて検証を行った。まず、頻繁に微粒子の取り込みが観察されたマイクログリアに着目した。マイクログリア初代培養系に微粒子を処置しリアルタイムイメージングを行ったところ、微粒子を貪食して小胞に内包したマイクログリアが、別のマイクログリアへと微粒子を受け渡す様子が観察された。最後に、神経細胞への微粒子曝露の影響を解析するため、神経細胞初代培養系に微粒子を処置した。その結果、微粒子は神経細胞内に取り込まれ、特に細胞体に集積することがわかった。また、微粒子を取り込んだ神経細胞は正常な神経細胞に比べ、短く細い突起を多く持っていた。以上の結果から、微粒子の脳内動態にマイクログリアが関与すること、また、微粒子が神経細胞に取り込まれると、神経形態を変化させることが示された。以上のような微粒子による脳細胞への影響が脳機能を変化させる可能性が考えられる。

A-2-4 〇浅田 眞由美¹、林 秀樹¹、高木 教夫¹ Mayumi Asada¹, Hideki Hayashi¹, Norio Takagi^{1 1}東京薬科大・薬・応用生化 プロモーター領域の DNA メチル化は、哺乳類における遺伝子発現制御機構の一つとして知られている。DNA 構成塩基のうち、主にシトシンが DNA methyltransferase (DNMTs) の働きによりメチル化され、5-methylcytosine (5mC) となる。DNA メチル化はいくつかの疾患の病態形成に関与していると報告されているが、脳梗塞後の DNA メチル化と病態形成との関連は詳細に把握されていない。そこで本研究では、脳梗塞に対する新たな治療戦略を提示する目的で、脳梗塞後の DNA メチル化と神経細胞死の関連について検討を行った。
まず初めに、一過性局所脳虚血を模倣する中大脳動脈閉塞再灌流 (middle cerebral artery occlusion / reperfusion : MCAO/R) モデルにおける DNA メチル化を検討した。その結果 MCAO/R 1 日後の虚血側大脳皮質において 5mC 陽性細胞数が非虚血側の 5mC 陽性細胞数の約 7 倍に増加していた。また、虚血側の 5mC 陽性細胞のうち、約 70% が神経細胞であった。そこで、初代培養大脳皮質神経細胞を用いてさらなる詳細な検討を行った。
以後の実験は、脳梗塞後に惹起される虚血性神経障害のメカニズムの一つである N-methyl-D-aspartate (NMDA) 受容体刺激性神経細胞死で検討した。NMDA 処置後の 5mC 陽性細胞数は、処置 30 分後をピークに一過性に増加し、処置 2 時間後にはコントロール群と同程度まで減少した。また、5mC 陽性細胞が観察される NMDA 処置 1 時間後まで de novo DNA メチル基転移酵素である DNMT3a のタンパク質量は維持されていたものの、それ以後はコントロール群と比較して顕著に減少した。さらに、NMDA 誘発性神経細胞死に対する DNMT 阻害薬 RG108 の影響を検討した結果、DNMT 阻害薬 RG108 は神経保護効果を示した。
　以上の結果から、脳梗塞後に惹起される神経細胞の DNA メチル化は脳梗塞病態の進展に寄与している可能性が示唆された。

A-2-5 〇柳澤 祥子¹、山田 大輔¹、吉岡 寿倫¹、飯尾 啓太²、岡 淳一郎¹、長瀬 博²、斎藤 顕宜¹ Shoko Yanagisawa¹, Daisuke Yamada¹, Toshinori Yoshioka¹, Keita Iio², Jun-Ichiro Oka¹, Hiroshi Nagase², Akiyoshi Saitoh^{1 1}東京理科大・院薬、²筑波大学睡眠研究機構 〔背景・目的〕過度な恐怖記憶は、外傷後ストレス障害(PTSD)や不安症等の精神疾患の病態と関連することが報告されている。消去学習とは、恐怖を獲得した環境に長期間または繰り返し曝露されることで、その環境が危険ではないことを新たに学習する過程であり、ヒトにおける認知行動療法の生物学的基礎課程と考えられている。そのため消去学習を促進することは、上記精神疾患の治療に有効であると考えられる。δオピオイド受容体(DOP)は情動に関わる脳部位に多く存在する。当研究室ではこれまでに、選択的DOP作動薬KNT-127が抗不安作用、消去学習促進作用を示すことを報告してきた。しかし、KNT-127が作用する脳領域については明らかでない。そこで本研究では、KNT-127の消去学習促進作用発現の際の作用脳部位を特定することを目的に検討を行った。
〔方法〕C57BL/6Jマウス(8週齢）を用いて文脈的恐怖条件づけ試験を行った。1日目に電気刺激（0.8 mA、1秒間、30秒間隔で8回）を与え条件づけを行い、2日目（消去学習）、3日目(テスト)に6分間同じ実験箱に再曝露した際の恐怖応答（freezing）を観察した。KNT-127は2日目の再曝露30分前に扁桃体および海馬に局所投与した。また、2日目の再曝露30分前にKNT-127を皮下投与した動物から、再暴露の60分後に扁桃体、海馬、内側前頭前野を採取し、それぞれの領域におけるリン酸化ERKと総ERKの比率をウェスタンブロット法により検討した。
〔結果・考察〕KNT-127を扁桃体内に局所投与することにより、2日目の再曝露におけるfreezingが有意に低下した。一方、3日目の再曝露時には2日目と同程度のfreezingを示し、KNT-127による消去学習促進作用は確認できなかった。また、2日目の再暴露60分後には扁桃体と海馬におけるERK1/2のリン酸化率が有意に上昇していたが、内側前頭前野では変化がみられなかった。さらに、条件付けしていないマウスにKNT-127を投与した場合にも扁桃体におけるERK1/2のリン酸化率を上昇させることが確認された。以上の結果より、KNT-127は再曝露時には扁桃体と海馬に作用していること、また扁桃体では抗不安作用を示すが、消去学習には作用しないことが示唆された。海馬への局所投与の影響については現在検討中である。

A-2-6 〇坂本 謙司^1,2、大川 祐依¹、浅野 大樹¹、森田 茜¹、森 麻美¹、中原 努¹ Kenji Sakamoto^1,2, Yui Okawa¹, Daiki Asano¹, Akane Morita¹, Asami Mori¹, Tsutomu Nakahara^{1 1}北里大・薬・分子薬理、²帝京大・薬・医薬品作用 【目的】緑内障患者において認められる網膜神経節細胞（RGC）傷害には，神経興奮毒性が関与している可能性が考えられている．生体内ではcystathionine γ-lyase（CSE）などによって硫化水素（H₂S）が産生されている．当研究室は，硫化水素ナトリウムなどのH₂S ドナーが，N-methyl-D-aspartic acid（NMDA）の硝子体内投与により誘発されるRGC傷害を抑制することを報告している．microRNA（miR）は，mRNAの発現量を抑制性に調節しており，その発現変動と神経変性疾患との関係が注目されている．miR-205の標的候補の1つとして，CSEをコードするmRNAが挙げられている．本研究の目的は，マウス網膜におけるmiR-205の発現変動とNMDAの硝子体内投与により誘発されるRGC傷害との関係を検討することである．
【方法】（1）miRの発現変動：7〜8週齢のC57BL/6Jマウスを用いた．片眼にNMDA（40 nmol/eye）を，反対眼にsalineを硝子体内投与した．NMDA投与0，4，8，12および24時間後に眼球を摘出して，網膜からtotal RNAを抽出し，定量的RT-PCRを行った．
（2）miR-205 inhibitorの神経保護作用：7〜8 週齢のICR系雄性マウスを用いた．両眼にmiRNA inhibitor negative control（NC）あるいはmiR-205 inhibitor（いずれも10 pmol/eye）を硝子体内投与し，その18時間後にNMDA（40 nmol/eye）を硝子体内投与した．7日後に網膜を単離し，網膜伸展標本を作製後，Alexa Fluor 488標識抗NeuN抗体を用いてRGCを標識した．共焦点レーザー顕微鏡を用いて画像を取得し，NeuN陽性細胞の残存率を求めた．
【結果】miR-205の発現量は，NMDA硝子体内投与8時間後において有意に増加した．NMDA硝子体内投与7日後におけるRGCの脱落は，miR-205 inhibitorの前投与により，有意に抑制された．
【考察】マウス網膜におけるグルタミン酸興奮毒性によるRGCの脱落には，miR-205の発現上昇が関与している可能性が示唆された．